SDS-PAGE電泳的常見問題解析

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1.關于凝膠的一些問題

膠的凝結(jié)不好，例如有花紋特別是濃度高的膠在冬天溫度較低的情況下，在分離膠的下部有波浪樣的花紋，凝膠不均勻。解決方法：加大TEMED和過硫酸胺的量，使其凝結(jié)速度加快。同時洗干凈玻璃板，防止有殘留的膠干結(jié)在玻璃板上。

膠不凝，解決方法：溫度較低時加大TEMED和過硫酸胺的量，過硫酸胺必須新鮮配制。如若還是不行重新配制一下緩沖溶液。

膠易碎，例如濃度較高的膠在染色和脫色過程以及掃描過程中破裂。解決方法：首先在上述過程中一定要動作輕緩，其次在室溫較高的情況下可以適當減少TEMED和過硫酸胺的量。

電泳完后膠上有很多長條紋的雜帶，解決方法：建議電泳緩沖液不要回收利用。配制膠的溶液一定要純。

2.凝膠時間不對

通常膠在30分鐘到1小時內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是TEMED，AP劑量不夠。如果凝的太快，可能是AP和TEMED用量過多，此時膠太硬易裂，電泳時易燒膠。

3.濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳的影響

前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進入引起的，一般對電泳結(jié)果不會有太大的影響。

4.樣品的處理

根據(jù)樣品分離目的不同，主要有三種處理方法：還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。

還原SDS處理：在上樣buffer中加入SDS和DTT（或Beta巰基乙醇）后，形成SDS與蛋白相結(jié)合的分子。

帶有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的保護SH基團，得到較窄的譜帶；另碘乙酸胺可捕集過量的DTT，而防止紋理現(xiàn)象的產(chǎn)生。100uL樣品緩沖液中加入10uL20%的碘乙酸胺，并在25℃下保藏30min。

非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品，一般只用1%SDS沸水中煮3min，未加還原劑，因而蛋白折疊未被破壞，不可作為測定分子量來使用。

5.條帶兩邊翹起中間凹下的原因（︶）

在較厚的凝膠中，由于凝膠不均勻冷卻，中間部分凝固不好。

電泳系統(tǒng)溫度偏高。

處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實驗。

6.條帶兩邊向下中間鼓起的原因（︵）

一般原因是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈，或聚合不*。

處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。

7.條帶偏斜

原因：電極不平衡或者加樣位置偏斜。

8.條帶兩邊擴散

原因：加樣量過多。

9.電泳的條帶過粗

電泳中條帶很粗是常見的事，主要是濃縮膠的原因。

處理辦法：適當增加濃縮膠的長度；保證濃縮膠貯液的pH正確；適當降低電壓。

10.目的蛋白質(zhì)條帶模糊

電泳凝膠濃度選擇不當。

低于10Kd的小分子蛋白質(zhì)要用Tricine膠。

靠近前沿的電泳帶分辨率不佳。根據(jù)分子量與凝膠孔徑的關系，選擇適當濃度的凝膠。

蛋白質(zhì)樣品水解。注意除去蛋白質(zhì)樣品的內(nèi)源性的水解酶，不要反復凍融。

電泳時間過長或過短。溴酚藍達到分離膠的底部即應該關閉電泳電源。

緩沖溶液、SDS都要新鮮配制。

避免加樣過多，提高分辨率。小體積樣品可給出窄帶，加樣體積根據(jù)樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15uL（即2-10ug蛋白質(zhì)）。

加熱變性后的蛋白質(zhì)樣品要放置到室溫即電泳，不要久放，因為蛋白質(zhì)的二硫鍵在高溫下可能是會斷開，但是暴露于空氣中溫度降低會重新形成二硫鍵，而且可能在過久放置過程中蛋白質(zhì)可能會再折疊，更不要扔到冰箱里保存。

11.“鬼帶"的出現(xiàn)及處理

“鬼帶"就是在跑構(gòu)象復雜的蛋白質(zhì)大分子時，在泳道頂端出現(xiàn)一些未知條帶或在加樣孔底部生成沉淀，這主要是因為還原劑在加熱的過程中被氧化失活，使解離的蛋白質(zhì)分子重新折疊和亞基重新締合，由于其分子量通常要比目標條帶大，所以會生成未知條帶或沉淀。

處理辦法：在加熱煮沸后，再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇，以補充不足的還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。

12.拖尾現(xiàn)象

主要是樣品溶解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。

處理辦法：加樣前離心；選擇適當?shù)臉悠肪彌_液，加適量樣品促溶劑；電泳緩沖液時間過長，重新配制；降低凝膠濃度。

13.紋理現(xiàn)象

主要是樣品不溶性顆粒引起的。

處理辦法：加樣前離心；加適量樣品促溶劑。

14.溴酚藍不能起到指示作用

我們在實驗中有時會出現(xiàn)溴酚藍已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。

主要原因：緩沖液和分離膠的濃度過高。

處理辦法：更換正確pH值的Buffer；降低分離膠的濃度。

15.甘氨酸在電極緩沖液中的作用

SDS-PAGE中樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液，電極液選TRIS/甘氨酸，電泳開始后，HCL解離成氯離子，甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質(zhì)帶負電荷，因此一起向正極移動，其中氯離子最快，甘氨酸根離子最慢，蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大，超過蛋白，因此在后面形成低電導區(qū)，而電場強度與低電導區(qū)成反比，因而產(chǎn)生較高的電場強度，使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動，形成以穩(wěn)定的界面，使蛋白聚集在移動界面附近，濃縮成一中間層。

16.電泳電壓很高但電流很低

現(xiàn)象：電壓50v以上，可電流卻在5mA以下。

主要原因：電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括：內(nèi)外槽裝反；外槽液過少等。

處理辦法：正確裝配電泳槽即可。

17.如何提高SDS-PAGE電泳分辨率

使聚丙烯酰胺的充分聚合，可以提高凝膠的分辨率。

建議做法：待凝膠在室溫凝固后，可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或冰箱放置，前者易導致凝固不充分，后者可導致SDS結(jié)晶。

18.電泳時間比正常要長

可能是因為凝膠緩沖系統(tǒng)和電級緩沖系統(tǒng)地PH選擇錯誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強度太高。

19.配膠緩沖液系統(tǒng)在電泳中的影響

緩沖液在電泳過程中的主要作用是維持合適的pH。電泳時正極與負極都會發(fā)生電解反應，正極發(fā)生的是氧化反應，負極發(fā)生的是還原反應，長時間的電泳將使正極變酸，負極變堿。緩沖液可以維持溶液兩極的pH保持基本不變。在濃縮膠中，pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，泳動效率低；而CL離子卻很高，兩者之間形成導電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動并聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。所以，pH對整個反應體系的影響是至關重要的，實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況，應首要考慮該因素。

                                                                                                                                      本篇轉(zhuǎn)載至實驗之家